همسانه‌سازی ژن آنزیم کلسترول‌اکسیداز سویه بومی ایرانی Rhodococcus sp. 502 در راستای تولید آفت‌کش بیولوژیکی پنبه

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش‌آموخته کارشناسی‌ارشد، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه پیام نور، تهران

2 دانشیار، دانشکده مهندسی انرژی و فنآوری‌های نوین دانشگاه شهید بهشتی، گروه بیوتکنولوژی

3 دانشیار، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه پیام نور، تهران

4 استادیار، گروه بیوشیمی و ژنتیک، دانشگاه علوم پزشکی لرستان و عضو علمی مرکز تحقیقات داروهای گیاهی رازی، دانشگاه علوم پزشکی لرستان، خرم‌آباد

چکیده

آنزیم کلسترول‌اکسیداز به­عنوان نسل جدیدی از آفت­کش­های بیولوژیک اثر آفت­کشی قوی بر روی آفت غوزه پنبه (Heliothis armigera) دارد. مکانیسم اثر کشندگی کلسترول‌اکسیداز مربوط به اکسیداسیون کلسترول در غشای اپیتیلیوم روده میانی حشرات می‌باشد که منجر به تخریب فیزیکی و ساختاری غشاء و در نتیجه ایجاد اختلالاتی در عملکرد غشاء و در نهایت سبب مرگ آفت می‌شود. تولید گیاهان مهندسی ژنتیک شده با ژن کدکننده آنزیم کلسترول ‌اکسیداز در جهت مقاوم‌سازی آن­ها به آفات، مستلزم انتخاب مناسب‌ترین سوش از نظر میزان بیان و فعالیت زیاد این آنزیم است. لذا این تحقیق با هدف همسانه سازی ژن آنزیم کلسترول‌اکسیداز در یک سیستم بیانی pET مناسب، جهت امکان هدایت پروتئین نوترکیب تولیدشده به فضای پری‌پلاسمی باکتری طراحی و اجرا شد. بدین منظور از ‌سویه باکتری (Rhodococcus sp. 502) بومی ایران، که دارای فعالیت کلسترول‌اکسیدازی بالا بود، جهت جداسازی ژن با PCR استفاده شد. محصول PCR ابتدا در پلاسمید خطی pJET و در نهایت در پلاسمید pET23a کلون و داخل میزبان (E.coli DH5α) ترانسفورم شد. پس از همسانه‌سازی و استخراج پلاسمید نوترکیب pET23a+cho و به‌منظور تأیید حضور ژن از آنزیم‌های HindIII و XhoI و تعیین توالی استفاده شده است. حضور باند 1600 جفت بازی در هضم آنزیمی  حضور ژن را تایید کرد. نتایج حاصل از آنالیز تعیین توالی حاکی از آن است که توالی به‌‌دست ‌آمده شباهت زیادی با کلسترول‌اکسیداز سویه‌های دیگر باکتری Rhodococcusموجود در NCBI دارد، که  از آن می‌توان در راستای تولید آفت‌کش بیولوژیکی در پنبه استفاده نمود.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Cloning of cholesterol oxidase gene from Iranian strain of Rhodococcus for production of cotton biological pesticide

نویسندگان [English]

  • Saba Bahrami 1
  • Masoud Tohidfar 2
  • Mohammad Ali Ebrahimi 3
  • Hamed Esmaeil Lashkarian 4
1 M.Sc in Agricultural Biotechnology, Department of Biotechnology, Payam-e-Noor University, Tehran, Iran
2 Department of Biotechnology, Faculty of Energy Engineering and New Technology, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran.
3 Associate Professor, Department of Biotechnology, Payame Noor University, Tehran, Iran.
4 Assistant Professor, Department of Genetic and Biochemistry and Razi Herbal Medicines Research Center,Lorestan University of Medical Sciences, Khoramabad, Iran.
چکیده [English]

Cholesterol oxidase enzyme, as a new generation of biological pesticides, has pesticides strong effect on the pest to cotton Heliothis armigera. The mechanism of action of cholesterol oxidase fatality related to the oxidation of cholesterol in the membranes of insect midgut epithelial which leads to physical destruction and the resulting disturbances in membrane structure and function and eventually death of the insect. In order to retrofitting genetically engineered plants against pests, production of them with the gene coding for cholesterol oxidase enzyme, require the best method for expression level and activity of this enzyme. Therefore, this study aimed to clone cholesterol oxidase enzyme in plasmid pET23a for possible guidance recombinant protein produced in bacterial periplasmic space. Rhodococcus sp. strain 502 that produce high level of cholesterol oxidase, was used for gene isolation by PCR. The PCR product was sub cloned in  plasmid pJET, subsequently for expression was cloned in pET23a, eventually was transformed into the host E.coli DH5α. Recombinant plasmid pET23a CHO was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing. The results of sequencing showed high similarity between our isolated gene sequence and the other cholesterol oxidase gene sequences in NCBI that can be used for production of biological pesticide. 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cholesterol Oxidase
  • cloning
  • pET23a
  • Cotton biological pesticides

مراجع

  1. Akhtar  T.A.,  Matsuba,  Y.,  Schauvinhold,  I.,  Yu,  G.,  Lees,  H.A.,  Klein,  S.E. and Pichersky, E. 2013.  The tomato cis-prenyltransferase gene family. Plant J. 73: 640-652.
  2. Badense, M.L., Hurtado, M.A. and Liacer, G. 2006. Searching for molecular markers linked to male sterility and self-compatibility in apricot. Plant Breeding 119: 157-160.
  3. Chen F., Tholl D., Bohlmann, J. and Pichersky, E. 2011. The family of terpene synthases in plants: A mid-size family of genes for specialized metabolism that is highly diversified throughout the kingdom. Plant J. 66: 212-229.
  4. Corbin, D., Greenplate, J., Wong, E. and Purcell, J. 1994. Cloning of aninsecticidal cholesterol oxidase gene and its expression inbacteria and in plant protoplasts. Appl. Environ Microbiol 60:4239-4244.
  5. Corbin, D.R., Grebenok, R.J. and Ohnmiess, T.E. 2001. Expression and chloroplast targeting of cholesterol oxidase in transgenic tobacco plants. Plant Physiol. 126(3): 1116-1128.
  6. Dayanand, A. and Patil, S.R. 2003. In: Detection of potential fungal isolates for the production of pectinase from deseeded dried sunflower head.
  7. Doukyu, N. 2009. Characteristics and Biotechnological Applications of Microbial Cholesterol Oxidase. Applied Microbiology and Biotechnology, 83(5): 825-837.
  8.  Etebari, K. and Matindost, E. 2008. Introduced a number of proteins insecticide as a fourth-generation pesticides Olive Special Edition (1). (In Persian)
  9. Kumari, L. and Kanwar, S. 2012. Cholesterol Oxidase and Its Applications. Advances in Microbiol. 2: 49-65.

10. Matsuba, Y., Nguyen, T.T.H, Wiegert, K., Falara, V., Gonzales-Vigil, E., Leong, B., Schafer, P., Kudma, D., Wing, R.A., Bolger, A.M., Usadel, B., Tissier, A., Fernie, A.R., Barry, C.S. and Pichersky, E. 2013. Evolution of complex locus for Terpene biosynthesis in Solano, The Plant Cell. 25: 2022-2036.

11. Omidbegi, R. 2010. Approaches to production and processing of medicinal plants. Published by Tarahan Nashr. Designers Publications, pp. 173-161. (In Persian)

12. Patil, S.R. and Dayanand, A. 2006. Optimization of process for the production of fungal pectinases from deseeded sunflower head in submerged and solid-state conditions. Bioresource Technology. 97(18):2340.

13. Purcell, J.P., Greenplate J.T., Jennings M.G., Ryerse J.S., Pershing J.C., Sims S.R., Prinsen M.J., Corbin D.R., Tran M., Sammons R.D. and Stonard R.J. 1993. Cholesterol oxidase: a potent insecticidal protein active against boll weevil larvae. Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1406-1413.

14. Rashno, M. 2014. Identification, isolation and biochemical activities of the enzyme cholesterol oxidase compared Lorestan soil indigenous bacteria for use as biological pesticides cotton, M.Sc. Thesis. Payame Noor University, Tehran. (In Persian)

15. Sharma, A. and Gupta, M.N. 2001. Purification of pectinases by three-phase partitioning. Biotech. Letters. 23(19): 1625-1627.

16. Somkuti, G.A., Solaiman, D.K.Y. and Steinberg, D.H. 1992. Expression of Streotomyces sp. cholesterol oxidase in Lactobacillus casei. Appl. Microbiol. Biotechnol. 37:330-334.

17. Turfitt, G.E. 1994. The microbiological degradation of steroids: 2. Oxidation of cholesterol by Proactinomyces spp. Biochemical Journal. 38(5): 492-496.

18. Volontè, F., Pollegioni, L., Molla, G., Frattini, L., Marinelli, F. and Piubelli, L. 2010. Production of Recombinant Cholesterol Oxidase Containing Covalently Bound FAD in Escherichia coli, BMC Biotechnology, 10: 33-35.

19. Yang, J.Y., Li, Y., Chen, S.M. and Lin, K.C. 2011. Fabrication of a cholesterol biosensor based on cholesterol oxidase and multiwall carbon nanotube hybrid composites. International Journal of Electrochemical Science, 6: 2223-2234.

پژوهش های پنبه ایران
دوره 3، شماره 2
اسفند 1394
صفحه 55-64

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار